فهرست مطالب:

فصل اول.. 1

مقدمه و کلیات.. 1

1-1 مقدمه. 2

1-2 ژن‌های کاندیدا و اهمیت آن‌ها 4

فصل دوم. 5

بررسی منابع. 5

2-1 مروری کوتاه بر خصوصیات بیولوژیکی و زیستگاهی ماهیان مورد مطالعه. 6

2-1 کپور شکلان.. 6

2-1-1 خانواده کپور ماهیان.. 6

2-1-1-1 ماهی سفید. 7

2-1-1-2 کپور معمولی.. 8

2-2 زیستگاه 9

2-3 تغذیه. 10

2-4 سن بلوغ. 10

2-5 رشد و عوامل موثر بر آن.. 10

2-5-1 تنظیم رشد. 11

2-5-2 هورمون رشد. 11

2-5-3 کنترل ترشح هورمون رشد. 12

2-5-4 اثرات متابولیکی هورمون رشد. 12

2-5-4-1 افزایش سرعت پروتئین سازی در بیشتر سلول‌های بدن.. 12

2-5-4-2 افزایش رونویسی هسته‌ای DNA برای ساخت RNA… 13

2-5-4-3 افزایش میزان چربی‌ها برای تولید انرژی.. 13

2-5-4-4 کاهش مصرف کربوهیدرات‌ها 13

2-6 ژن هورمون رشد. 13

2-7 نشانگرهای ژنتیکی.. 14

2-7-1 نشانگرهای ریخت شناسی.. 15

2-7-2 نشانگرهای فیزیولوژیکی.. 15

2-7-3 نشانگرهای سیتوژنتیکی.. 15

2-7-4 نشانگرهای پروتئینی.. 15

2-7-5 نشانگرهای DNA یا نشانگرهای مولکولی.. 16

2-8 نشانگرهای DNA مبتنی بر واکنش زنجیره‌ای پلیمراز 16

2-9 واکنش رنجیره ای پلیمراز (PCR) 17

2-9-1 بافر RCR.. 18

2-9-2 کلرید منیزیم (Mgcl2) 18

2-9-3 دی اکسی نوکلئوتیدها (dNTPs) 18

2-9-4 آنزیم تک پلیمراز 19

2-9-5 آغازگرها 19

2-10 چند شکلی فضایی رشته‌های منفردSSCP) ) 19

2-11 مروری بر برخی پژوهش‌های انجام شده: 20

فصل سوم. 22

مواد و روش‌ها 22

3-1 نمونه برداری.. 23

3-2 بررسی فاکتور وضعیت… 23

3-3 استخراج DNA به روش نمکی بهینه یافته. 23

3-3-1 طرز تهیه بافرهای استخراج DNA… 23

3-4 تعیین ویژگی‌های کمی و کیفی DNA استخراج شده: 24

3-4-1 ژل آگارز 24

3-4-2 رنگ آمیزی ژل آگارز 25

3-5 تعیین غلظت DNA استخراج شده با استفاده از اسپکتوفتومتر. 26

3-6 واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) 26

3-6-1 پروتکل و مواد استفاده شده در PCR.. 26

3-6-2 مراحل PCR.. 27

3-6-3 تنظیم سیکل‌های حرارتی PCR.. 28

3-6-3-1 واسرشته سازی قطعه الگو. 28

3-6-3-2 اتصال آغازگرها: 28

3-6-3-3 بسط (طویل سازی) آغازگرها: 28

3-7 چندشکلی فضایی در تک رشته DNA (SSCP) 29

3-8 الکتروفورز محصولات SSCP روی ژل اکریل آمید. 30

3-8-1 تهیه ژل پلی اکریل آمید. 30

3-8-2 آماده سازی دستگاه الکتروفورز عمودی.. 31

3-8-3 رنگ آمیزی با نیترات نقره 32

3-8-3-1 مراحل انجام رنگ آمیزی نیترات نقره: 32

3-9 مراحل انجام کار 33

3-10 تعیین توالی الگوهای باندی مشاهده شده در جمعیت مورد مطالعه. 34

3-11 تجزیه تحلیل داده‌ها 34

3-11-1 تجزیه و تحلیل آماری ژنتیک جمعیت و ارتباط نشانگر- صفت… 34

3-11-2 تجزیه و تحلیل بیوانفورماتیک توالی‌های به دست آمده 35

فصل چهارم. 36

نتایج.. 36

4-1 بررسی کمیت و کیفیت DNA استخراج شده 37

4-2 تکثیر قطعات مورد نظر. 37

4-2-1 ژن GH-2 ماهی سفید. 37

4-2-2 ژن GH-1 ماهی کپور معمولی.. 38

4-3 الگوهای باندی مشاهده شده جایگاه GH… 38

4-3-1 ژن GH-2 ماهی سفید. 38

4-3-1-1 بررسی فاکتور وضعیت ماهی سفید. 39

4-3-1-2 بررسی ارتباط بین نشانگر- صفت در جایگاه GH-2 ماهی سفید. 39

4-3-2 ژن GH-1 ماهی کپور معمولی.. 40

4-3-2-1 بررسی فاکتور وضعیت کپور معمولی.. 41

4-3-2-2 بررسی ارتباط بین نشانگر- صفت در جایگاه GH-1 ماهی کپور معمولی.. 41

4-5 تجزیه و تحلیل بیوانفورماتیک… 42

4-5-1 توالی یابی.. 42

4-5-2 مقایسه توالی GH-2 ماهی سفید و ماهی کپور معمولی.. 43

4-6 تعیین ژنوتیپ الگوهای باندی جایگاه GH-2 ماهی سفید پس از توالی‌یابی.. 47

4-7 برآورد مقدار وفور ژنی و ژنوتیپی جایگاه GH-2 ماهی سفید. 48

فصل پنجم. 50

بحث و نتیجه گیری.. 50

5-1 بحث و نتیجه گیری.. 51

5-2 پیشنهادات.. 53

منابع. 54

پیوست‌ها: 60

فهرست اشکال و جداول و نمودارها

شکل 2-1 ماهی سفید. 8

شکل 2-2 کپور معمولی.. 9

شکل 3-1 دستگاه الکتروفورز افقی.. 25

جدول 3-1 اجزای تشکیل دهنده بافر بارگذاری.. 26

جدول 3-2 مواد استفاده شده در واکنش زنجیره‌ای پلیمراز 27

شکل 3-2 دستگاه ترموسایکلر. 27

جدول 3-3 توالی آغازگر اختصاصی برای جایگاه GH… 28

جدول 3-4 دماهای استفاده شده در سیکل‌های PCR (درجه سانتی‌گراد) 29

جدول 3-5 زمان‌ها و تعداد سیکل‌های استفاده شده در PCR.. 29

جدول 3-6 مواد لازم جهت تهیه بافر بارگیری SSCP.. 30

جدول 3-7 مواد لازم برای تهیه 65 میلی لیتر ژل اکریل آمید. 31

جدول 3- 8 مواد لازم جهت تهیه محلول ثابت کننده 32

جدول 3-9 مواد لازم جهت تهیه محلول رنگ‌آمیزی.. 32

جدول 3-10 مواد لازم جهت تهیه محلول ظاهرسازی.. 33

شکل 4-1 نمونه‌های از DNA استخراج شده به روش نمکی بهینه یافته. 37

شکل 4-2 محصولات PCR یک قطعه از ناحیه اگزون 4، اینترون 4 و اگزون 5 برای ژن GH-2 در ماهی سفید. 37

شکل 4-3 محصولات PCR یک قطعه از ناحیه اگزون 4، اینترون 4 و اگزون 5 برای ژن GH-2 در ماهی کپور معمولی   38

شکل 4-4 نمونه‌ای از باندهای SSCP ژن GH-2 ماهی سفید. 38

جدول 4-1 فراوانی الگوهای باندی مشاهده شده در نمونه‌های مطالعه شده 39

جدول 4-2 بررسی فاکتور وضعیت ژنوتیپ های مشاهده شده در ماهی سفید. 39

جدول 4-3 جدول ANOVA و آنالیز آماری GLM برای ماهی سفید. 39

جدول 4-4 نتایج مقایسه میانگین حداقل مربعات الگوهای باندی مختلف برای صفت فاکتور وضعیت ماهی سفید. 40

شکل 4-5 هشت الگوی باندی مشاهده شده در جایگاه ژن GH-1 ماهی کپور معمولی.. 40

جدول 4-5. فراوانی‌های ژنوتیپی جایگاه ژنی GH-1 مشاهده در 150 نمونه ماهی کپور مطالعه شده 40

جدول 4-6 بررسی فاکتور وضعیت ژنوتیپ های مشاهده شده در ماهی کپور معمولی.. 41

جدول 4-7 جدول ANOVA و آنالیز آماری GLM برای ماهی کپور معمولی.. 41

جدول 4-8 نتایج مقایسه میانگین حداقل مربعات الگوهای باندی مختلف ژن GH-1 برای صفت وزن ماهی کپور معمولی   42

شکل 4-6 مقابسه توالی‌ها بین نمونه‌های ماهی سفید با ژنوتیپ دارای الگوهای باندی A، B و C.. 43

شکل 4-7 هم ترازی سه نمونه ارسال شده ماهی سفید برای توالی یابی. 44

نمودار 4-1 نتایج حاصل از توالی‌یابی ماهی سفید. 47

نمودار 4-2 هتروزیگوتی الگوی باندی A و C. 48

جدول 4-9 فراوانی ژنوتیپ‌های مشاهده شده و مورد انتظار در جایگاه GH-2 ماهی سفید. 48

جدول 4-10 فراوانی ژنوتیپی و آللی جایگاه GH-2 ماهی سفید. 49

چکیده

هورمون رشد (GH) مهم‌ترین هورمون کنترل کننده رشد سلول‌های سوماتیک و موثر در سنتز پروتئین، چربی و کربوهیدرات‌ها می‌باشد. هدف از پژوهش حاضر شناسایی چند شکلی‌های ژن GH-1‌در ماهی کپور معمولی و GH-2 در ماهی سفید با استفاده از تکنیک PCR-SSCP و ارتباط آن با صفات مرتبط به رشد (فاکتور وضعیت، طول و وزن بدن) بوده است. تعداد 150 قطعه ماهی کپور در 4 گروه سنی 4، 6، 12و 24 ماهه و 150 قطعه ماهی سفید در سن 3 ماهگی به طور تصادفی انتخاب  و از باله دمی برای استخراج DNA استفاده شد. پس از استخراج DNA به روش نمکی بهینه یافته، دو قطعه به اندازه 373 و 410 جفت باز به ترتیب برای جایگاه‌های ژنی  GH-1در ماهی کپور معمولی و GH-2 در ماهی سفید تکثیر و تعیین ژنوتیپ افراد به روش SSCPانجام گرفت. در نمونه‌های مورد مطالعه 8 الگوی باندی متفاوت A، B، C، D، E، F، G و H در جمعیت کپور ماهیان بهترتیببافراوانی‌های 33/31، 67/10، 67/20، 67/22، 4، 2، 67/2 و 6 درصد و 3 الگوی باندی متفاوت A، B و C به ترتیب با فراوانی 67/24، 67/58 و 67/16 درصد در جمعیت ماهی سفید مشاهده شد. تجزیه و تحلیل نشانگر- صفت ارتباط معنی دار آماری بین ژنوتیپ های مختلف ژن GH-2 ماهی سفید با صفات وزن، طول بدن و فاکتور وضعیت وجود ندارد. همچنین بین ژن GH-1 ماهی کپور در سه گروه سنی 4 ماه، 6 ماه و 12 ماه با صفت وزن ارتباط معنی دار آماری (05/0>P) وجود دارد در حالی که با صفات طول و فاکتور وضعیت ارتباط معنی داری مشاهده نشد. آزمون چند دامنه‌ای دانکن برای جمعیت ماهیان کپور معمولی در سه گروه سنی 4 ماه، 6 ماه و 12 ماه نشان داد که ماهیان با ژنوتیپ دارای الگوی باندی D به طور معنی داری (05/0>P) دارای وزن بیشتری نسبت به سایر ژنوتیپ ها بودند. همچنین آزمون چند دامنه‌ای دانکن برای ماهی سفید نشان داد که افراد با ژنوتیپ C،CF بالاتری (05/0>P)  نسبت به افراد با ژنوتیپ A داشتند. از نظر صفات وزن و طول در داخل جمعیت ماهیان سفید، هیچ کدام از ژنوتیپ ها با یکدیگر اختلاف معنی دار نداشتند. نتایج تعیین توالی قطعه تکثیری در ماهی سفید نشان داد که در الگوی باندیC، نه SNP به صورت تغییرنوکلوتیدیT به G در موقعیت 82 جفت بازی، A به C در موقعیت 113 جفت بازی، G به A در موقعیت 207 جفت بازی، G به A در موقعیت 254 جفت بازی، G به A در موقعیت 269 جفت بازی، G به A در موقعیت 296 جفت بازی، A به G در موقعیت 307 جفت بازی، C به A در موقعیت 308 جفت بازی و G به A در موقعیت 346 جفت بازی رخ داده است. همچنین در موقعیت 366 جفت بازی در الگوی باندی B یک جهش از نوع حذف مشاهده شد. مشاهده هشت الگوی باندی مختلف در جایگاه مورد مطالعه در این پژوهش نشان دهنده تنوع زیاد در جایگاه ژنی GH-1 در جمعیت ماهیان کپور معمولی می‌باشد. بنابراین با توجه به اهمیت اقتصادی ماهی کپور معمولی و ماهی سفید در صنعت پرورش و  وجود همبستگی بین چندشکلی‌های مشاهده شده و صفات رشد احتمالا بتوان از این جایگاه نشانگری در برنامه‌های اصلاح ن‌ژادی در جمعیت‌های مورد مطالعه بهره برد. به هر حال جهت دست یابی به نتایج مطمئن نیاز به تکرار آزمون با تعداد نشانگر بیشتر از این جایگاه‌های ژنی و اندازه نمونه‌های بزرگ‌تر از این جمعیت‌ها می‌باشد.